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恒温水浴箱对人血浆中盐酸克仑特罗浓度的测定 |
点击次数:2348 发布时间:2011-8-19 |
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盐酸克仑特罗(clenbuterolhydrochloride,CL),又名氨哮素、瘦肉精、双氯醇胺等,化学名为α [(叔丁氨基)甲基] 4 氨基 3,5 二氯苯甲醇盐酸盐,是一种β2 受体激动药。其松弛支气管平滑肌作用强而持久,临床上主要用于治疗支气管哮喘。由于药物半衰期长,在体内代谢慢,临床应用时,可能出现肌肉震颤、心慌、心悸、头疼、恶心、呕吐等症状,特别是对于高血压、心脏病、甲亢、青光眼、前列腺肥大等疾病患者危险性较大,可能会加重病情,导致意外,所以对CL的临床血药浓度监测非常重要。本实验采用HPLC-电化学法测定CL血药浓度,参考有关资料,着重对人血浆中CL的提取方法、色谱条件、内标物质的选择以及方法的准确性和重现性等进行了研究,并对患者血浆样本进行分析。 1材料 1.1仪器 岛津LC 6A高效液相色谱仪,LED 6A电化学检测器,JS 3030色谱工作站,超声波仪, 恒温水浴箱(上海和呈仪器生产),高速离心机。 1.2药品与试剂 盐酸克仑特罗对照品(新乡同心制药厂,批号20030601,纯度98.7%),乙腈(色谱纯),辛基磺酸钠(Sigma),其余试剂均为分析纯。CL对照品和对苯二酚内标均用0.02mol?L-1HCl配制成标准储备液。 2方法与结果 2.1色谱条件 色谱柱:NucleodurC18(250mm×4.6mm,10μm);流动相:磷酸二氢钾缓冲液-乙腈=7∶3(V/V);磷酸二氢钾缓冲液内含0.02mol?L-1磷酸二氢钾,0.15mmol?L-1Na2EDTA,0.2mmol?L-1辛基磺酸钠,pH5.0,并通过0.45μm的滤膜过滤后与乙腈按比例混合,流速1.2mL?min-1,检测器电位0.80V(Ag/AgCl电极),进样量20μL。 2.2血浆样本的处理 取15mL离心试管依次加入0.2mol?L-1NaOH溶液2mL,0.5mg?L-1对苯二酚内标液100μL,肝素抗凝血浆样本1mL,混匀,加乙醚-乙醇(8∶2)提取液8mL,封盖,用超声波仪提取20min,3000r?min-1离心15min;取上清液转移至另一洁净试管中,加入0 .2mol?L-1NaOH2mL混匀洗涤,3000r?min-1离心5min,取上清液层转移至一洁净试管中,置60℃水浴上通N2挥干,残留用0.1mL流动相重组后,取20μL供高效液相色谱仪测定,用内标法以峰面积定量。 2.3系统适应性试验 通过对流动相的配比、pH、流速、检测电位的调整实验,确定在上述色谱条件下,空白血浆加内标及CL对照品的测试结果见图1。内标及CL保留时间分别为4.975、5.652min。两者分离度>5,达到基线分离,且无空白干扰。
2.4标准曲线的绘制 取空白血浆7份,每份1mL,各加入100μL内标液,分别加入适量标准溶液使之配成5、10、20、40、60、100、120μg?L-1的标准系列;按2.2项下操作测定,由色谱工作站直接求出CL对内标的峰面积比值(Y)与相应的浓度比值(X)的回归方程,Y=0.753X+0.011,r=0.9993。检出限为0.015μg?L-1(rSN=3),线性范围为1.5~120μg?L-1。 2.5回收率和精密度的测定 对高、中、低3份CL含量为5、20、40μg?L-1的标准血样分别按本法检测,其回收率分别为90.5%、94.7%、96.3%,平均为93.8%。同时3份样本按本法分别平行检测5次,RSD分别为2.6%、3.7%、4.2%。 2.6样品测定 我们采用该方法测定了3例患者口服CL后的血药浓度,患者每次口服该药30μg,服药后2.5h和24h静脉取血。结果见表1。
3讨论 国内外文献报道的HPLC法测定生物样本CL的前处理方法中,采用乙醚-丁醇、己烷-乙酸乙酯等溶剂体系,提取回收率均偏低,影响检测灵敏度。因为盐酸克仑特罗在中性、酸性下易溶于水、甲醇、乙醇,不溶于乙醚等,而在碱性下可溶于乙醚。本实验在碱性条件下用乙醚∶乙醇混合比分别为6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的4种混合提取液对同一份加标样品,各作3次平行对比测定。其平均回收率分别90.6%、92.2%、95.3%、93.6%。结果表明乙醚∶乙醇混合比8∶2作提取液时,其结果佳。 本法处理样品简单,测定准确、快速,采用电化学检测器检测,专属性强,灵敏度高,且不受其他药物的干扰,更适用于临床盐酸克仑特罗血药浓度的监测。
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